产品目录

本试剂盒采用新型的用于磷酸化蛋白富集和纯化的NTA-Fe琼脂糖凝胶，配合优化的缓冲液，可简单、快速、灵活、高效且高特异性地与细胞、动植物或者微生物裂解液、血清、腹水等样品中磷酸化蛋白结合，从而用于磷酸化蛋白或磷酸化蛋白复合物的富集和纯化、免疫沉淀(IP)或免疫共沉淀(Co-IP)。

本试剂盒中NTA-Fe琼脂糖凝胶是一种由高质量的次氮基三乙酸(NTA)共价偶联至琼脂糖凝胶，再通过NTA的4个结合位点螯合三价铁离子(Fe³⁺)制备而成的琼脂糖凝胶。的NTA-Fe琼脂糖凝胶能高效且快速地进行磷酸化蛋白和磷酸化多肽的富集和纯化，蛋白纯化步骤简便，纯化条件温和，且蛋白纯化后可直接进行下游实验。本试剂盒可特异性地结合磷酸化蛋白，并可以借助离心机等分离设备非常便捷地应用于磷酸化蛋白或其蛋白复合物的纯化或免疫沉淀等实验。

• 使用便捷，提供了配套试剂：本试剂盒提供了磷酸化蛋白纯化所需的相关试剂，为磷酸化蛋白的富集和纯化带来了极大的便利。同时本试剂盒的NTA-Fe琼脂糖凝胶储存在特殊保护液中，不含甘油，配合试剂盒提供的缓冲液，可以通过离心机等设备实现快速高效的分离。
  
• 稳定性高、特异性强、靶蛋白结合量高：与国内外大多数的同类产品相比，本试剂盒中的NTA-Fe琼脂糖凝胶铁离子配基密度较高，铁离子脱落程度低，对磷酸化蛋白的结合具有很强的特异性。本试剂盒中的NTA-Fe琼脂糖凝胶每毫升悬浊液含约50%琼脂糖凝胶沉淀，含有不少于30μmol/mL的NTA-Fe3+，通常每毫升琼脂糖凝胶沉淀可结合>24mg磷酸化蛋白，具体的最大结合量和磷酸化蛋白的分子量大小等相关。
  
• 结合目的蛋白速度快：本试剂盒中的NTA-Fe琼脂糖凝胶使用了NTA螯合的铁离子，粒径在90μm左右。通常30分钟内即可完成磷酸化蛋白吸附的过程，60分钟内完成目的蛋白纯化或免疫沉淀操作。缩短操作时间可以有效避免在长时间操作过程中目的蛋白的降解或变性，充分保证目的蛋白的活性。
  
• 可高效洗脱磷酸化蛋白：本试剂盒根据磷酸化蛋白的结构、生物学功能及后续应用的要求等，使用磷酸盐进行多次洗脱。洗脱时间短，洗脱效率高。

磷酸化蛋白是研究最多的一种蛋白质翻译后修饰，蛋白质的磷酸化和去磷酸化对生物体的众多生命活动起着至关重要的作用。质谱分析可精确鉴定蛋白质中发生的磷酸化修饰，并定位到具体的氨基酸残基，是磷酸化蛋白组学研究的核心技术。在进行质谱分析前，需要将蛋白质直接酶解成片段，但是这样的操作不仅增加了样品的复杂度，并且由于酶解后大量非磷酸化肽段抑制磷酸化肽段的质谱信号从而降低了磷酸化肽段的质谱检测灵敏度。因此，在质谱分析前对磷酸化蛋白或多肽进行有效的分离富集非常重要。

本试剂盒中的NTA-Fe琼脂糖凝胶是基于固定化金属离子亲和层析(IMAC)技术研发而成。研究发现，二价金属离子如铜离子、锌离子和镍离子可用于His-tag蛋白的分离纯化，而三价铁离子和四价钛离子可用于磷酸化蛋白的富集和纯化。

• 本试剂盒中NTA-Fe琼脂糖凝胶每毫升悬浊液中共含约0.5mL琼脂糖凝胶沉淀。NTA-Fe琼脂糖凝胶标注的体积为悬浊液总体积。每毫升悬浊液可以用于纯化约12mg分子量约为60kD的磷酸化蛋白。磷酸化蛋白分子量的大小会影响本制品可以纯化的目的蛋白的mg数。

如果每个样品需要使用1mL裂解液或200μL裂解液，本试剂盒足够进行5次或25次磷酸化蛋白纯化。对于分子量为60kD的磷酸化蛋白，每次可纯化的磷酸化蛋白最大量为12mg或2.4mg。每个样品的裂解液用量可以酌情进行调节。

• 本试剂盒纯化时不可以使用磷酸盐类缓冲液，以免和磷酸化蛋白形成竞争结合，从而降低NTA-Fe琼脂糖的磷酸化蛋白载量。
  
• 本试剂盒中的NTA-Fe琼脂糖凝胶经测试，冻融3次不影响效价，但仍建议适当分装减少冻融次数。频繁使用建议4℃保存。
  
• 本试剂盒中的NTA-Fe琼脂糖凝胶使用前要适当充分重悬，即颠倒若干次使琼脂糖凝胶混合均匀，混匀操作须轻柔，不宜剧烈涡旋震荡等，避免琼脂糖凝胶破碎等。
  
• 本试剂盒使用过程中，缓冲试剂如Tris、HEPES、MOPS等的浓度不宜超过100mM，Triton、Tween、NP-40的浓度不宜超过2%，脱氧胆酸钠、CHAPS的浓度不宜超过1%。其它未提及试剂的兼容性可以参考上述试剂，但有待实验验证。
  
• 在纯化或免疫沉淀时，建议设置阳性和阴性对照组。
  
• 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4℃或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。为有效抑制蛋白降解，可以在蛋白样品中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，但不要添加EDTA。例如通用型蛋白酶抑制剂混合物、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(质谱兼容)、哺乳动物样品专用蛋白酶抑制剂混合物、哺乳动物样品专用蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物等。
  
• 如果离心不能完全除去蛋白样品中的不溶物，可以将样品溶液用0.45μm的滤膜过滤。
  
• 如果自行配制裂解液，需注意DTT、巯基乙醇和EDTA等对NTA-Fe琼脂糖凝胶与磷酸化蛋白的结合可能有一定影响，但Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)或RIPA裂解液(强，无抑制剂)等都完全适用。

• 缓冲液的准备：
  
  • 参考下表，按照每个样品使用1mL裂解液的比例，准备相关试剂。如果使用不同的裂解液体积，其它试剂的用量需要按比例进行调整。
    

    步骤	所需溶液	每次实验用量
    细胞裂解与样品制备	裂解缓冲液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物）	1mL
    NTA-Fe琼脂糖制备	Binding/Wash Buffer	约10mL
    磷酸化蛋白结合	NTA-Fe琼脂糖凝胶	1mL
    洗涤（3次）	Binding/Wash Buffer	每次2mL
    洗脱	Elution Buffer	约5mL

  • 含抑制剂裂解液的配制：细胞裂解液中推荐在裂解细胞或组织样品加入通用型蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(质谱兼容)，这样可以有效避免蛋白的降解和磷酸化蛋白的去磷酸化。请勿加入EDTA。参考上表，按照每1000万细胞使用1mL含抑制剂裂解液的比例，配制适量的含抑制剂裂解液。例如将Lysis Buffer与通用型蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(质谱兼容)中的蛋白酶抑制剂混合物(50X)、磷酸酶抑制剂混合物(50X)按照50:1的比例混合，即在1mL的Lysis Buffer中各加入20μL蛋白酶抑制剂混合物(50X)、磷酸酶抑制剂混合物(50X)，得到约1mL含抑制剂裂解液。配制好的含抑制剂裂解液宜放置在冰浴或4℃。
    
    • 含抑制剂裂解液宜现用现配，不宜配制后冻存并留作后续使用。如果有特殊需求，可以尝试百奥莱博的其它多种蛋白酶、磷酸酶和去乙酰化酶抑制剂混合物。
• 细胞或组织样品的裂解和准备：样品裂解后宜立即进行后续的磷酸化蛋白的纯化、免疫沉淀或免疫共沉淀等操作，如果不能立即进行后续的实验，可以-20℃或-80℃冻存，但冻融可能会影响蛋白与蛋白的相互作用。所有的样品裂解步骤宜在冰浴或4℃操作，以尽量减少蛋白降解的可能性。样品准备好后，注意取一定量作为Input或Total，以用于后续的Western等检测。
  
  • 悬浮细胞的样品裂解和准备：250～1000×g室温离心5分钟收集细胞。如有必要，可以使用生理盐水洗涤1次，然后吸净残留的液体。轻轻vortex或者弹击管底以把细胞尽量分散开。按照每1000万细胞加入1mL的比例加入含抑制剂裂解液。轻弹管底或适当吹打，以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，建议分装成50～100万细胞/管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。充分裂解后，10000～14000×g在4℃离心3～5分钟，取上清，即可进行后续的免磷酸化蛋白的纯化、免疫沉淀或免疫共沉淀等操作。
    
    • 裂解后会出现少量不溶性物质，主要为基因组DNA等，离心后会产生沉淀物。
  • 贴壁细胞样品的裂解和准备：吸除培养液。如有必要，可以使用生理盐水洗涤1次，然后吸净残留的液体。按照每1000万细胞(相当于一个10cm的细胞培养皿)加入1mL的含抑制剂裂解液，适当吹打，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触动物细胞1～2秒后，细胞就会被裂解。植物细胞宜在冰上裂解2～10分钟。充分裂解后，10000～14000×g在4℃离心3～5分钟，取上清，即可进行后续的磷酸化蛋白的纯化、免疫沉淀或免疫共沉淀等操作。
    
    • 裂解后会出现少量不溶性物质，主要为基因组DNA等，离心后会产生沉淀物。
  • 组织样品的裂解和准备：
    
    • 把组织剪切成细小的碎片。如果组织样品本身非常细小，也可以不再进行剪切。
      
    • 按照每10～20mg组织使用100～200μL的比例加入含抑制剂裂解液。如果裂解不充分可以使用更多的含抑制剂裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
      
    • 用玻璃匀浆器匀浆，或使用组织研磨仪研磨，直至充分裂解。也可以把组织样品冷冻后液氮研磨，研磨充分后加入裂解与洗涤液进行裂解。
      
    • 充分裂解后，10000～14000×g在4℃离心3～5分钟，取上清，即可进行后续的磷酸化蛋白的纯化、免疫沉淀或免疫共沉淀等操作。每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200μL含抑制剂裂解液裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为15～25mg/mL，不同状态的不同组织有所不同。
      
      • 裂解后很可能会出现少量不溶性物质，主要为基因组DNA等，离心后会产生沉淀物。
• 目标蛋白与NTA-Fe琼脂糖凝胶结合：
  
  • 亲和纯化柱准备：适当颠倒混匀NTA-Fe Agarose，每个空柱管盖上下底盖后，从上口装入1mL NTA-Fe Agarose (沉淀体积为0.5mL)，静置5分钟。取下底盖，整个柱子装入15mL离心管内，1000×g在4℃离心1分钟去除液体，随后盖上底盖。
    
    • 上述离心过程，推荐使用15mL离心管辅助收集柱中的液体。
  • 平衡：加入2mL Binding/Wash Buffer，盖上顶盖，轻轻重悬NTA-Fe Agarose，去除顶盖和底盖，1000×g在4℃离心1分钟，去除上清。再重复4次，即共洗涤5次，随后盖上底盖。
    
  • 样品中磷酸化蛋白结合：加入步骤2中准备好的样品。盖上顶盖，置于旋转混匀仪或摇床上，室温混合30分钟。
    
    • 如有必要，可以在2～8℃旋转混合1小时，以防止目标蛋白降解。
  • 取下顶盖和底盖，将亲和纯化柱放置在洁净的15mL离心管中，1000×g在4℃离心1分钟。收集并保留穿流液，后续测定穿流液中的蛋白浓度就可以计算出结合效率。
    
    • 对于上清部分，可适量保存并用于检测纯化的效果。
  • 洗涤：加入2mL Binding/Wash Buffer，盖上顶盖，轻轻重悬NTA-Fe Agarose，去除顶盖和底盖，1000×g在4℃离心1分钟，以洗涤亲和纯化柱。重复洗涤3次。
    
  • 洗脱：加入1mL Elution Buffer，放入洁净的15mL离心管中，1000×g在4℃离心1分钟。收集洗脱液。如果需要，再重复本步骤洗脱4次，收集样品到新的离心管中，还可以得到一些磷酸化蛋白。在确定洗脱效果之前不合并洗脱液。
    
  • 可通过SDS-PAGE或者Western直接检测蛋白，或者通过蛋白浓度测定试剂盒进行浓度检测。推荐使用BCA法蛋白浓度测定试剂盒。
    
  • 磷酸化蛋白浓缩：根据样品选择最合适的截留分子量的超滤管。向超滤管中加入5mL混合好的洗脱液，盖上超滤管管盖并将其放入转子中，离心30～45分钟至样品体积为150～200μL。收集并保留超滤管底部的蛋白样品，即为纯化后的磷酸化蛋白。
• 亲和纯化柱的清洗和再生：
  
  • 盖上底盖，向亲和纯化柱中加入1mL Elution Buffer，盖上顶盖，轻轻重悬NTA-Fe Agarose，去掉顶盖和底盖，1000×g在4℃离心1分钟，去除上清。重复3次。
    
  • 盖上底盖，向亲和纯化柱中加入1mL 20%乙醇，盖上顶盖，使NTA-Fe Agarose重悬，1000×g在4℃离心1分钟，去除上清。重复3次。
    
  • 盖上底盖，加入1mL 20%乙醇用于长期保存，使总体积等于初始悬浮液体积，盖上顶盖，置于4℃或-20℃保存，并可用于下一次同种蛋白的纯化。待检测的不同样品，不建议使用清洗和再生的亲和纯化柱。